液相氧化属蔷薇科植物
黑果腺肋花楸又名不老莓、高效果腺野樱莓，液相氧化属蔷薇科植物。色谱素营养丰富，法测果实中富含花青素、定黑多酚以及黄酮等多种功能成分，肋花具有抗炎、楸提取物抗辐射、中氯降血糖、化矢含量保肝等功效，车菊同时还可以清除机体自由基。及抗究果实既可生食，性研亦可加工制作保健饮料、高效果腺果汁、液相氧化果酒和果酱等食品，色谱素具有健脾理气、益气止咳的作用。目前国内外对黑果腺肋花楸的研究极少，开发和利用其功能成分对以后的研究极其重要。
花色苷是一类广泛存在于植物体内的水溶性的黄酮类天然色素，是由花青素与各种糖类形成的糖苷。其中95％的花色苷中均含有六种花青素，即天竺葵色素、矢车菊素、飞燕草色素、芍药色素、牵牛花色素和锦葵色素，通过强酸水解可将花青素转化成6种常见花色素中的一种或几种。花青素具有较强的抗氧化性，能够清除人体内的自由基，抑制肝脂质的过氧化现象，并呈现一定的量效关系，能够阻止活性氧对DNA、蛋白质、脂质和其他生物大分子的损害，清除有害的自由基，因此具有预防心血管疾病，预防癌症，缓解糖尿病，保护眼睛等功效，现在已经被应用到食品、药品、保健品、化妆品等中。目前，尚未见关于黑果腺肋花楸提取物中氯化矢车菊素含量测定的报道。本文参照相关文献，供试品溶液制备采用加热回流酸化甲醇水解法，该工艺成熟且简单易于操作。采用HPLC法测定黑果腺肋花楸提取物中氯化矢车菊素的含量，为黑果腺肋花楸果的进一步开发应用提供试验依据。
一、材料与方法
1、材料与试剂
黑果腺肋花楸提取物(吉林化工学院化学与制药工程学院实验室自制)；氯化矢车菊素(对照品，HPLC≥98％，成都曼思特生物科技有限公司)；甲醇、磷酸(色谱纯，天津市大茂化学试剂公司)；水为重蒸馏水；其余所用试剂均为国产分析纯。
2、仪器与设备
LC-2000型高效液相色谱仪(大连依利特分析仪器有限公司)；W5-100SP型恒温水浴锅(上海申生科技有限公司)；FA-2004N型电子分析天平(上海精密科学仪有限公司)；KQ250DE超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；TU-1950双光束紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；T-50溶剂过滤器(天津市实验设备有限公司)；RE-52AA隔膜真空泵(天津市津腾实验设备有限公司)。
3、方法
（1）黑果腺肋花楸提取物中氯化矢车菊素的HPLC含量测定方法
①色谱条件色谱柱为大连依利特ODS2C18(4.6ininx250mm，5um)；流动相：A为甲醇，B为0.2％磷酸水溶液(W)，程序为0～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱温：30℃；进样量：20皿；检测波长为276am。
②对照品溶液的制备精密称取干燥至恒重的氯化矢车菊素对照品1.80mg，置于50mL的容量瓶中，用2％盐酸甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为0.036mg.mL-1的对照品溶液，置于冰箱中避光保存备用。
③供试样品溶液的制备方法
称取干燥至恒重的黑果腺肋花楸提取物1g，放入圆底烧瓶中，加入2％的盐酸甲醇溶液30mL，置于90℃水浴中回流1h，冷却至室温，摇匀，过滤，将滤液转移至50mL容量瓶中并用2％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(O.22μm)滤过，取续滤液，作为供试品溶液。
④流动相的选择
试验中主要考察了甲醇-0.2％磷酸水溶液、乙腈-0.2％磷酸水溶液、甲醇-3％甲酸水溶液等各种流动相对黑果腺肋花楸提取物中氯化矢车菊素保留时间和分离度的影响。
⑤线性关系考察
吸取氯化矢车菊素的对照品溶液，配制成质量浓度分别为3.6、7.2、14.4、21.6、28.8、36.0μg·／mL的系列对照品溶液，分别进样20μL，测定氯化矢车菊素的峰面积。以吸光度氯化矢车菊素的峰面积为纵坐标，质量浓度C为横坐标绘制标准曲线，得回归方程Y=37486C+3.2127，R=0.9995(n=6)。结果表明氯化矢车菊素进样浓度在3.6～36.0μg·mL-1范围内与峰面积线性关系良好。
⑥重复性试验
取同一批号黑果腺肋花楸提取物6份，称取干燥至恒重的黑果腺肋花楸提取物1g，放入圆底烧瓶中，加入2％的盐酸甲醇溶液30mL，置于90℃水浴中回流1h，冷却至室温，摇匀，过滤，将滤液转移至50mL容量瓶中并用2％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(O.22μm)滤过，取续滤液，作为供试品溶液。各进样量20μL，测定氯化矢车菊素的峰面积。氯化矢车菊素峰面积分别为602.18、612.34、616.52、621.13、629.28、613.52，RSD为1.54％，结果表明含量测定方法具有较好的重复性。
⑦仪器精密度试验
吸取对照品及供试品溶液，连续进样6次，每次进样20μL，分别测定对照品及供试品溶液中氯化矢车菊素的峰面积。供试品中氯化矢车菊素峰面积分别为624.23、623.84、631.37、645.85、623.59、611.80，RSD为1.79％。对照品中氯化矢车菊素峰面积分别为1065.54、1140.96、1122.17、1097.34、1093.65、1138.23，RSD为2.65％，结果表明仪器精密度符合要求。
⑧供试品溶液的稳定性试验
吸取供试品溶液，分别于0、2、4、8、12、24h进样20μL，测定氯化矢车菊素的峰面积。供试品中氯化矢车菊素峰面积分别为617.32、634.17、618.97、630.15、631.22、625.34，RSD为1.09％，表明供试品溶液在室温下24h内稳定，满足测定要求。
⑨检测限与定量限试验
吸取对照品溶液适量，逐步稀释，直到检测峰高为基线噪声的3倍为止，计算氯化矢车菊素的最低检测浓度，试验结果表明氯化矢车菊素的最低检测限为0.360μg／mL。吸取对照品溶液适量，逐步稀释，直到检测峰高为基线噪声的l0倍为止，计算氯化矢车菊素的定量限，试验结果表明氯化矢车菊素的定量限为0.144μg／mL。
(2)供试品溶液制备方法的优化
①正交试验
根据单因素试验结果，基本定位了作用于花青素水解的三个要素，分别为水解温度、反应时间和酸浓度。选择水解温度、反应时间、酸浓度作为考察因素，按三因素三水平进行试验，因素水平表见表1。
②工艺验证性试验
称取黑果腺肋花楸提取物3份，每份0.5g，放入圆底烧瓶中，加入3％的盐酸甲醇溶液15mL，置于100℃水浴中回流120min，冷却至室温，摇匀，过滤，将滤液转移至25mL容量瓶中并用3％的盐酸甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.22μm)滤过，弃去初滤液，取续滤液作为供试品溶液。色谱柱为大连依利特ODS2C18(4.6inin×250mm，5μm)；流动相：A为甲醇，B为0.2％磷酸水溶液(V/V)，程序为0～30min，40％A；流速：0.8mL／min；柱温：30℃；进样量：20μL；检测波长为276nm。分别进样20μL，测定氯化矢车菊素的峰面积，计算氯化矢车菊素的平均含量及RSD值，确定正交试验所选取的水解条件的稳定性。
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